Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología. Myriam Consuelo López Páez

o bebidas contaminadas con materia fecal, lo cual sugiere una asociación con especies patógenas (29,30). Si se encuentran formas parasitarias morfológicamente compatibles con E. histolytica, se debe reportar como complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii (31).

      Identificación del complejo Entamoeba histolytica/ Entamoeba dispar/Entamoeba moshkovskii

      A continuación, se describen las técnicas utilizadas para la identificación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, las cuales incluyen el examen con azul de metileno amortiguado y las coloraciones especiales.

      Examen con azul de metileno amortiguado

      Materiales y reactivos

      Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjetos, cubreobjetos, tubo de ensayo, aplicador, solución amortiguadora de acetato (ver anexo 17) y azul de metileno amortiguado (ver anexo 18) (7,31,32).

      

      Procedimiento

      1. Tomar una pequeña cantidad de materia fecal con un aplicador y llevarla a un tubo de ensayo.

      2. Mezclar con una pequeña cantidad de azul de metileno amortiguado.

      3. Incubar a 37 °C durante 15 minutos.

      4. Hacer el montaje en un portaobjetos y colocarle un cubreobjetos.

      5. Examinar la preparación en 10X y 40X.

      A través de esta técnica, es posible observar las características morfológicas del núcleo de los trofozoítos. Esta característica y otros aspectos morfológicos enumerados en la tabla 1.2 facilitan la diferenciación de los trofozoítos de los macrófagos, los cuales también suelen estar presentes en la muestra y son un factor de confusión frecuente.

      Tabla 1.2. Cuadro comparativo de las características de los trofozoítos y los macrófagos de

      Coloraciones especiales

      Las coloraciones especiales descritas a continuación incluyen la tinción con hematoxilina férrica y la tinción tricrómica.

      Tinción de hematoxilina férrica

      Esta técnica permite detallar la morfología del núcleo, el cariosoma, la membrana y la distribución de la cromatina, los cuerpos cromatoides y las vacuolas (35,36) como se puede observar en la tabla 1.3.

      

      Tabla 1.3. Comparación de la morfología del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii y otras amibas intestinales.

      Materiales y reactivos

      Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19), fijador de alcohol polivinílico (PVA, por su sigla en inglés) (ver anexo 20), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), solución de albúmina (ver anexo 22), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), alumbre férrico (ver anexo 24), hematoxilina al 5 % (ver anexo 25), solución de ácido pícrico (ver anexo 26), xilol y líquido de montaje (citorresin).

      Procedimiento

      1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn o fijador PVA y conservar hasta el momento de la coloración.

      2. Filtrar la mezcla anterior con un pedazo de gasa.

      3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

      4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 400 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

      5. Preparar el etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 95 % a partir de alcohol al 100 %.

      6. Preparar la solución saturada de alcohol yodado.

      7. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregarle varias gotas de solución de albúmina para disolver el sedimento (entre cuatro o cinco gotas).

      8. Tomar una gota del preparado y colocarla sobre un portaobjetos. Extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

      9. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

      10. Colocar los portaobjetos horizontalmente sobre un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 18 horas a temperatura ambiente.

      11. Servir los alcoholes al 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % y 100 % en su respectivo recipiente marcado y tapado.

      12. Preparar el alumbre férrico.

      13. Pasar los portaobjetos del alcohol yodado a etanol al 50 % durante 3 minutos; luego, a un recipiente con agua destilada durante 3 minutos, y por último, al recipiente con alumbre férrico durante 1 hora.

      14. Preparar la hematoxilina al 5 %.

      15. Preparar el ácido pícrico.

      16. Colocar las placas en un recipiente con agua destilada durante 1 hora.

      17. Colocar las placas en la solución de trabajo de hematoxilina al 5 % durante 2 horas. Si la solución de trabajo de la hematoxilina es de buena calidad, las placas tomarán un color morado.

      18. Colocar las placas en un recipiente con ácido pícrico durante 1 minuto para decolorar. Tener cuidado de no exceder este tiempo.

      19. Colocar las placas en un recipiente y dejarlo bajo el chorro de agua del grifo durante 30 minutos.

      

      20. Pasar las placas por los recipientes con las diferentes concentraciones de alcohol de la siguiente forma: etanol al 30 % durante 15 minutos, etanol al 50 % durante 15 minutos, etanol al 70 % durante 30 minutos, etanol al 85 % durante 15 minutos, etanol al 95 % durante 25 minutos y etanol al 100 % durante 15 minutos.

      21. Usar guantes y tapabocas para colocar las placas en xilol en un recipiente tapado adecuadamente. Evitar el contacto directo del xilol con la piel.

      22. Sacar uno por uno los portaobjetos del recipiente con xilol y sin dejarlos secar, poner una o dos gotas de citorresin sobre el extremo del extendido. De inmediato, colocar una laminilla, hacer presión y permitir que la solución se difunda. Limpiar los excedentes de los bordes con una gasa antes de dejar secar.

      23. Observar al microscopio de luz con objetivos de 10X, 40X y 100X.

      Tinción tricrómica

      Al igual que la tinción de hematoxilina férrica, la tinción tricrómica permite observar las estructuras morfológicas de quistes y trofozoítos (28,38,39), como se puede ver en la tabla 1.3.

      Materiales y reactivos

      Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19) o solución fijadora PVA (ver anexo 20), solución de albúmina (ver anexo 22), colorante tricrómico (ver anexo 27), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), etanol al 30 %, 50 %,