Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Коллектив авторов

      FITC – флуоресцеинизотиоцианат

      FLAP – Fluorescence Localization After Photobleaching (локализация флуоресценции после фотоотбеливания)

      FLIM – fluorescence lifetime imaging microscopy (микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции)

      FLIP – Fluorescence Lossin Photobleaching (потеря флуоресценции во время фотоотбеливания)

      FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleachin (восстановление флуоресценции после фотоотбеливания)

      FRET – Fдrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии)

      GPDH – глицерофосфатдегидрогеназа

      LDH – лактатдегидрогеназа

      PBFI – potassium-binding benzofuran isophtalate

      PPI – пропидия йодид

      PPDA – парафенилендиамин

      RITC – родаминизотиоцианат

      SBFI – sodium-binding benzofuran isophtalate

      SDS – додецилсульфат натрия

      SHIM – Second-harmonic imaging microscopy (микроскопия с использованием регистрации второй гармоники)

      SNAP25 – Sy Naptosomal-Associated Protein, 25 kD

      SNARE – Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor

      TRITC – тетраметилродамин-5(6) – изотиоцианат

      ПРЕДИСЛОВИЕ

      В последние годы благодаря достижениям квантовой физики, молекулярной биологии и иммуноцитохимии, классические морфологические дисциплины приобрели совершенный инструмент для молекулярного анализа клеточных и тканевых структур. Сейчас можно констатировать, что на основе всестороннего использования новых молекулярных подходов происходит выделение передового направления в морфологии – молекулярной морфологии. Молекулярная морфология, аккумулируя знания, накопленные классической гистологией, эмбриологией, и патологической анатомией, способна занять ключевое место в интеграции клеточной биологии, биохимии, физиологии, молекулярной генетики и протеомики при решении фундаментальных проблем и прикладных задач биомедицинских исследований. Молекулярная морфология, используя постоянно расширяющиеся возможности новых методов конфокальной микроскопии, а также оптической микроскопии сверхвысокого разрешения, в скором времени должна решить насущную задачу создания нового поколения методов трехмерного молекулярного анализа клеточных и тканевых структур, пригодных для использования не только в практике научного исследования, но и в диагностических целях. Ожидаемые новые методы должны быть просты, надежны в использовании, высокоселективны и высокочувствительны. Успешное решение поставленной задачи требует от исследователя глубоких знаний о современных методических приемах иммуноцитохимии, флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Одной из важных задач, стоящих перед морфологом, занимающимся научными исследованиями, является участие в комплексных исследовательских программах, объединяющих специалистов разного профиля с целью решения конкретной научной проблемы. Квалифицированному специалисту-морфологу для успешного выполнения задач комплексных междисциплинарных исследований уже недостаточно владения только основами общей, частной морфологии и патологии, но требуется также и понимание главных биофизических принципов, лежащих в основе феноменов, используемых при создании приборов, предназначенных для флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. Без этого невозможно разобраться в сложных настройках современных приборов, от правильного использования которых зависит окончательный результат кропотливой подготовительной работы. Облегчить специалистам-морфологам и научным работникам смежных специальностей знакомство с новыми методами микроскопии и показать, как можно с их помощью решать различные задачи, связанные с изучением структур клеток и тканей, должна помочь настоящая книга.

      Технической базой для реализации представленных в приложениях протоколов и иллюстраций, помещенных на вклейках, послужил комплекс оборудования и программного обеспечения, разработанный фирмой Zeiss (Германия), который включает конфокальные лазерные микроскопы LSM 710 и LSM 510 Meta. Иммуноцитохимические протоколы и общие принципы работы с конфокальным микроскопом универсальны и могут успешно использоваться с оборудованием любых производителей.

      Настоящее руководство аккумулирует многолетний опыт сотрудников лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины, связанный с использованием методов конфокальной лазерной микроскопии и иммуноцитохимии.

      Научные исследования, результаты которых использованы при написании этой книги, были выполнены при поддержке Российского научного фонда (проект № 14-15-00014).

Д. Э. Коржевский

      Глава 1.

      ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ

      Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием