HPLC optimal einsetzen. Группа авторов

sind ebenso wichtig und können die Kombination von Trennmodi, die unter dem Gesichtspunkt der Selektivität recht attraktiv aussieht, in der Praxis unbrauchbar machen. Zum Beispiel ist die Kombination einer Normalphasen-(NP)- Trennung (d. h. nicht modifiziertes Kieselgel als stationäre Phase, Hexan als mobile Phase) mit einer RP-Trennung für einige Anwendungen attraktiv, weil die NP- Trennung von adsorptiven Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase dominiert wird, während die RP-Trennung von der Verteilung der Analyten in eine gebundene stationäre Phase dominiert wird. Dieser Unterschied in den Retentionsmechanismen kann zu hochgradig komplementären Selektivitäten führen. Allerdings stoßen wir in diesem Fall auf eine größere praktische Schwierigkeit, da die unpolaren mobilen Phasen mit einem hohen Anteil organischer Lösungsmittel, die für NP-Trennungen verwendet werden, mit den wasserreichen mobilen Phasen, die für RP-Trennungen verwendet werden, nicht mischbar sind – zumindest nicht über einen breiten Mischungsbereich. Dieser Umstand schränkt die Verwendung einiger Kombinationen von Trennmodi wie NP-RP ein, obwohl selbst in diesem Fall das Mischbarkeitsproblem durch die Injektion sehr kleiner Mengen von 1D-Eluat in große 2D-Säulen beherrscht werden kann [19]. Pirok und Schoenmakers haben die Kenntnisse über die Kompatibilität diverser Trennungen in der 2D-LC gesammelt und in der in Abb. 1.3 dargestellten Tabelle zusammengefasst. Grau schattierte Kombinationen sollten gut funktionieren, während hellgrau schattierte Kombinationen mindestens ein oder mehrere Probleme erzeugen, die gelöst werden müssen, bevor sie für eine 2D-Trennung ausgewählt werden. Leser, die an einer detaillierteren Erklärung aller Informationen in dieser Tabelle interessiert sind, werden auf die Originalarbeit von Pirok und Schoenmakers verwiesen [20]. Die Tabelle wird im Zuge der Weiterentwicklung der 2D-LC-Technologie ständig aktualisiert; eine aktuelle Version ist auf unserer Website²⁾ zu finden.

      Abb. 1.3 Matrix zur Kompatibilität der verschiedenen Trennungsmodi bei der Verwendung in der ersten oder zweiten Dimension von 2D-LC-Systemen. Abdruck mit Genehmigung aus [20].

1.3.3 Bestimmung der Komplementarität von Trennungen

Sobald wir eine erste Auswahl der beiden Trennmodi für unsere 2D-LC-Trennung getroffen haben, müssen wir die Qualität der resultierenden Trennung beurteilen. Für spezifischere Trennungen sind wir normalerweise am meisten daran interessiert, eine oder mehrere Zielsubstanzen untereinander oder von der Probenmatrix aufzulösen. In diesem Fall reicht es aus, zu beurteilen, inwieweit die 2D-Trennung die Substanzen getrennt hat, die von der 1D-Säule koeluieren; dies ist ein Maß für die Komplementarität der beiden Trennungen. Bei umfassenderen Trennungen interessiert uns in der Regel, inwieweit durch das Zusammenspiel von 1D- und 2D-Trennung die Bestandteile der Probe über den gesamten Trennbereich verteilt sind. Die Notwendigkeit, dies zu beurteilen, hat viele Gruppen dazu veranlasst, eigene Metriken zu entwickeln, die in neueren Artikeln kritisch diskutiert und verglichen wurden [21, 22]. In unserer eigenen Arbeit haben wir den in Abb. 1.4 dargestellten Ansatz verwendet, der darauf hinausläuft, den Anteil des verfügbaren 2D-Trennbereichs, der die Peaks enthält, zu schätzen, indem die Anzahl der Segmente, die Peaks enthalten, ermittelt und durch die Gesamtzahl der Segmente des Trennbereichs geteilt wird. Während der Methodenentwicklung passen wir die Elutionsbedingungen in beiden Dimensionen an, um die Peaks so breit wie möglich über den Trennbereich zu verteilen und so eine möglichst 100-prozentige Abdeckung des Raumes zu erreichen. Dies ist in der Praxis nur selten möglich, aber einige Anwendungen können mehr als 90 % Abdeckung erreichen [23].

      Abb. 1.4 Darstellung des häufig verwendeten Ansatzes zur Schätzung des Anteils des 2D-Trennraums, der bei der Analyse realer Proben von Peaks belegt wird. Die graue Umrandung erfasst die Bereiche, in denen Peaks normalerweise auftreten können. Außerhalb der Umrandung liegen die Totzeiten und Äquilibrierungszeiten der ersten und zweiten Dimension. Nach [24].

1.4 Auswahl der Trennungsbedingungen

      Neulinge bei mehrdimensionalen Trennungen sprechen oft davon, dass sie von der Anzahl der Variablen, die bei der Entwicklung einer 2D-Methode zu berücksichtigen sind, und der scheinbaren Komplexität von 2D-Trennungen überfordert sind. Es stimmt zwar, dass bei einer 2D-Methode mehr Variablen zu berücksichtigen sind als bei einer 1D-Methode, aber bei einer methodischen Herangehensweise ist es möglich, die Methodenentwicklung so anzugehen, dass man nicht überfordert wird. Im Folgenden betrachten wir die Methodenentwicklung von zwei verschiedenen Ausgangspunkten aus:

      1 1. es existiert bereits eine 1D-Methode, die wir in die 1D-Trennung einer 2D-Methode umwandeln wollen,

      2 2. die 2D-Methode muss von Grund auf entwickelt werden, wobei wir nicht durch die Parameter einer bestehenden 1D-Methode eingeschränkt sind.

      1.4.1 Mit Vorgabe feststehende Bedingungen in der ersten Dimension

Angenommen, wir wollen eine 2D-Methode entwickeln, indem wir eine 2D-Trennung zu einer bestehenden 1D-Methode hinzufügen. Dies ist in Fällen üblich, in denen eine 1D-Methode zur Trennung und Bestimmung der Konzentrationen mehrerer Verunreinigungen in einem Wirkstoff verwendet wird. Wenn diese Methode auf UV-Detektion beruht und plötzlich ein neuer Peak auftritt, lautet die erste Frage – was ist dieser neue Peak? Diese Frage lässt sich oft schnell mit einem einfachen Heartcut-Ansatz (LC-LC) und dem Hinzufügen einer 2D-Trennung lösen, die eine MS-Detektion erlaubt. Dies ermöglicht die Erfassung des neuen, unbekannten Peaks, dessen Übertragung auf die 2D-Säule, die Trennung der Bestandteile der Fraktion voneinander und von dem Puffer der 1D-mobilen Phase und schließlich die Elution und Detektion durch Massenspektrometrie. Die Entwicklung einer solchen Methode ist im Prinzip einfach, aber sobald man sich die Variablen ansieht, stößt man schnell auf ein Problem. Angenommen, die bestehende 1D-Methode läuft mit einer Flussrate von 1 ml/min und der zu bestimmende Peak ist 5 s breit auf halber Höhe. Wenn wir diesen Peak vollständig erfassen wollen, inklusive eines Sicherheitsabstands davor und danach, um leicht Retentionsverschiebungen von einer Analyse zur nächsten zu berücksichtigen, dann müssten wir einen etwa 20 s breiten Anteil des 1D-Eluats sammeln (8σ Peakbreite, plus 10% auf jeder Seite). Bei einer Flussrate von 1000 μl/min entspricht dies einem Fraktionsvolumen von etwa 333 μl. Als Injektionsvolumen für die 2D-Trennung ist diese Menge selbst für die größten heute gebräuchlichen analytischen Säulen (z. B. 150 mm × 4,6 mm Innendurchmesser) zu groß und wird die Qualität der 2D-Trennung erheblich beeinträchtigen. Dies ist der erste Punkt, an dem eine wichtige Entscheidung getroffen werden muss. Wir haben drei Hauptoptionen (Leser, die sich für nähere Einzelheiten interessieren, werden auf die neuere Literatur verwiesen; siehe [15]):

      1 1. Injizieren Sie die gesamte Fraktion, wie sie ist, in eine große 2D-Säule und hoffen Sie auf das Beste. Dies funktioniert gut in Fällen, in denen der Zielanalyt aus der 1D-Säule in einem Eluat enthalten ist, welches ein schwaches Lösungsmittel für die 2D-Säule darstellt (z. B. 1D-Eluat mit 10/90 ACN/Wasser, der in eine mobile 2D-Phase mit 20/80 ACN/Wasser injiziert wird), aber dies ist nicht immer möglich oder praktikabel.

      2 2. Injizieren Sie einen kleineren Anteil des 1D-Peaks, um das Fraktionsvolumen handhabbarer zu machen (z. B. 40 μl). Dieser Ansatz löst das Problem des Injektionsvolumens, führt aber möglicherweise zu neuen Problemen:a) es besteht die Gefahr, dass Analyten fehlen, die im vorderen oder hinteren Teil des 1D-Zielpeaks eluieren, undb) die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes ist nicht gut, da er empfindlich auf kleine Verschiebungen der 1D-Retentionszeit reagiert.

      3 3. Die Option, die dem Analytiker die größte Kontrolle bietet, ist die Verwendung einer aktiven Modulationstechnik, um die Auswirkungen des großen Fraktionsvolumens auf die 2D-Trennung zu steuern. Die gängigsten Ansätze sind:• Verdünnung des 1D-Eluats mit schwachem Lösungsmittel unter Verwendung einer zusätzlichen Pumpe (z. B. Verdünnung mit Wasser im Falle einer RP-Trennung in der zweiten Dimension)• Aktive Lösungsmittelmodulation unter Verwendung eines Ventils