Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал. Андрей Брюховецкий

сквозь культуральную вставку, проводили с использованием высокоэффективной количественной микроскопии (Cell-IQ, CM Technologies, Великобритания) с временными отрезками 24—48—72—96—120 ч; регистрировали количество Red CMTPX Dye-позитивных объектов как на границе, так и внутри культуральной вставки. Полученные результаты верифицировали методом цитофлуориметрии.

      Спустя 24 ч после начала совместного культивирования наблюдали формирование клеточного вала из флуоресцирующих клеток, располагающихся по периметру культуральной вставки с клетками глиомы. Этот феномен был отчетливо выражен в сокультурах, содержащих опухолевые клетки, и отсутствовал в лунках планшета, где стволовые клетки были совмещены с фибробластами и астроцитами (рис. 2 А—Г).

      Рис. 2.⠀Перераспределение ГСК в планшете при совместном

      культивировании через 24 ч. А – опухолевые клетки внутри культуральной вставки; Б – сокультура ГСК и фибробластов: формирование вала не наблюдается, увеличение 5x; В – сокультура ГСК и астроцитов: формирование вала не наблюдается, ув. 10x; Г – сочетанная культура ГСК и клеток глиомы С6 – формирование клеточного вала по периметру культуральной вставки, содержащей опухолевые клетки, ув. 5x

      В культурах, содержащих опухолевые клетки, ГСК мигрировали сквозь культуральную вставку и визуализировались среди неокрашенных клеток глиомы в форме округлых объектов, отвечающих на воздействие лазера устойчивым флуоресцентным сигналом, регистрируемым в спектре, соответствующем Red CMTPX (577⁄602 нм). В культурах, содержащих фибробласты и астроциты, регистрировались только единичные Red CMTPX-позитивные объекты. В культуральных вставках, оставленных пустыми, выявлялись только солитарные клетки, соответствующие спектру флуоресценции ГСК (табл. 2).

      Примечание: данные представлены в виде М ± s.e.m., N = 12 для каждой группы, по каждой точке.

      Подсчет числа ГСК, мигрировавших сквозь пористую мембрану или сосредоточенных по периметру культуральной вставки, показал четкое увеличение числа флуоресцирующих элементов в сокультурах, содержащих клетки глиомы, начиная со 2-го по 5-й день эксперимента (рис. 3). Значимых динамических изменений числа ГСК на этапах совместного культивирования культур с астроцитами и фибробластами не наблюдали (рис. 4).

      Рис. 3.⠀ГСК человека, мигрировавшие в лунки с глиомой С6.

      Окраска CellTracker™ Red CMTPX. Конфокальная микроскопия, флуоресценция при воздействии лазера λ = 546 нм; ув.: об. 10х

      Рис. 4.⠀Динамика накопления стволовых клеток в культуральных вставках, содержащих клетки глиомы линии С6, астроциты, фибробласты, и в контрольных вставках. По оси абсцисс – время сокультивирования

      (24—48—72—96—120 ч), по оси ординат – число флуоресцирующих клеток во вставке (М ± s.e.m., N = 9 по каждой точке)

      Очевидно, направленная миграция ГСК к клеткам глиомы обусловлена продукцией опухолевыми клетками сигнальных молекул. Поскольку