Beobachtungen und Experimente zur Frühentwicklung von Hydractinia echinata (Fleming 1828). Sebastian Nehls

RPh-Fluoreszenzmikroskopie und "kontraktiler Bogen"

       4.3.2 Weitere Folgerungen aus RPh-Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikros-kopie und Beobachtung

       4.3.3 Effekte von Cytochalasin B auf die Cytokinese

       4.4 Mögliche F-Actin-unabhängige Komponenten des Cytokinesemechanismus

       5 Zusammenfassung

       6 Literatur

       Danksagung

      

      1 Einleitung

      Hydractinia echinata ist eine weitverbreitete marine Hydrozoenart (Athecata, Hydractiniidae), die getrenntgeschlechtliche Polypenstöcke mit ausgeprägtem Polymorphismus bildet. Die Medusengeneration fehlt, stattdessen sind Gonophore (Gonozooide, Geschlechtspolypen) vorhanden, die ihre Geschlechtsprodukte ins freie Wasser abgeben. Aus einem Embryo entsteht eine Planulalarve, die sich schließlich festheftet und einen Primärpolypen bildet.

      Über den Furchungsmodus von H. echinata herrscht insofern Übereinstimmung, daß er total und weitgehend äqual ist. Bunting (1894) skizzierte und beschrieb die Furchung in einer Weise, die eine bestimmte Festlegung der Blastomerenanordnung suggerierte, dennoch am ehesten als irregulär zu bezeichnen ist. Andere Autoren beschrieben eine Radiärfurchung (Teissier u. Teissier 1927; van de Vyver 1964, 1967) oder eine Pseudospiralfurchung (Müller 1975). Die Pseudospiralfurchung, anarchische bzw. irreguläre Furchung bei Hydrozoen, namentlich bei Hydractinia echinata, wurde schließlich als artifiziell und nur unter schlechten Bedingungen in Aquarienkultur vorkommend abgetan (van de Vyver 1968, 1980; Fioroni 1992, S. 139). (Aufgrund des großen Regulationsvermögens entstehen aus solchermaßen sich furchenden Keimen dennoch normale Larven.) Die meisten der Autoren sind sich darüber einig, daß spätestens nach der vierten Furchung eine große innerartliche Variabilität auftritt und eine weitere Verfolgung der Furchung durch die geringe Größe und Undurchsichtigkeit der dotterreichen Blastomeren stark erschwert wird.

      Bei H. echinata sind die ersten beiden Furchungsteilungen meridional vom animalen Pol ausgehend (unilateral) und senkrecht zueinander; die dritte ist äquatorial (Teissier u. Teissier 1927; Teissier 1931; van de Vyver 1964). Dieses Furchungsschema ist typisch für die meisten Hydrozoen (Kühn 1913; Mergner 1971). Bei Sertularia (Amphisbetia) operculata sollen manchmal zweite und dritte Teilungsebene vertauscht sein (Teissier 1931). Auch Freeman (1981b) hat an den Eiern von Phialidium gregarium, besonders bei "einer Minderheit von Weibchen" (dortige Abb. 2, S. 170) derartiges festgestellt. Später kam er zu der Aussage, bei Hydrozoen sei ausschließlich die erste Furchungsebene festgelegt (Freeman 1983). Die zweite Furchung bei H. echinata scheint bei oberflächlicher Betrachtung tatsächlich äquatorial zu sein. Schlawny und Pfannenstiel (1991) zeigten durch Anheftung von Nilblau-Sulfat-Partikeln, daß dieser Eindruck nur durch eine Drehung des Embryos auf dem Untergrund entsteht - der animale Pol dreht sich nach oben - und daß die Ebene der zweiten Furchung (in den meisten Fällen) meridional ist. Sie vermuteten eine Cytoskelett-vermittelte Verlagerung spezifisch dichterer Cytoplasmabereiche als Ursache dieser Drehung.

      Die meisten Hydrozoen besitzen eine asymmetrische Furchung, die sich vom animalen Pol in Richtung des vegetativen Pols vollzieht. Die Ausprägung der Asymmetrie variiert zwischen den verschiedenen Arten, so daß - wie z.B. bei Hydractinia - eine deutlich unilaterale Furchung mit "schneidender" Furche auftritt, oder aber die Furche schon sehr bald nach dem Furchungsbeginn zirkulär angelegt wird, z.B. bei Aequorea forskalea und Clava (Metschnikoff 1886; Kühn 1913; Mergner 1971). Eine asymmetrische Cytokinese findet sich bei verschiedenen embryonalen Zellen, kommt aber auch bei anderen Zellen vor (Tab. 1). Allen gemeinsam ist die exzentrische Lage des Mitoseapparates (Astern und Spindel aus Mikrotubuli) mit paratangentialer Lage der Mitosespindel. Der Mitoseapparat bestimmt in tierischen Zellen durch eine noch kaum aufgeklärte Interaktion mit dem Cortex den Ort und die Ebene der Furchung (Übersicht: Strome 1993; Hydractinia: Rappaport u. Conrad 1963). Unter seinem Einfluß bildet sich unter der Plasmamembran ein kontraktiler Ring, bzw. bei unilateraler Furchung ein Band oder Bogen aus Actin- und Myosin-II-Filamenten. Dieser kontraktile Ring ist an der Plasmamembran verankert und vermittelt durch seine Kontraktion die Cytokinese. Der Mitoseapparat spielt nach den meisten modernen Autoren keine mechanische, sondern nur eine induktive Rolle in der Cytokinese (Übersichten zur Cytokinese: Mabuchi 1986; Satterwhite u. Pollard 1992).

       Tabelle 1

      Einige Beispiele für das Vorkommen asymmetrischer Cytokinese außerhalb des Taxons Cnidaria. h = holoblastische Furchung; "h" = vollständige Cytokinese; m = meroblastische Furchung

      In der vorliegenden Arbeit sollte durch einfache Beobachtung, durch Vitalmarkierung und durch Zeitraffer-Videomikroskopie die oben beschriebene Drehung des Hydractinia-Keims bestätigt und ausführlicher untersucht werden. Da sich Formveränderungen des Keims als bedeutend erwiesen, wurde als Methode die Rasterelektronenmikroskopie hinzugezogen.

      Die Fluoreszenzmikroskopie läßt dadurch, daß selektiv bestimmte Strukturen sichtbar gemacht werden, auch intakte, dotterreiche Keime transparent erscheinen. Durch die z.T. kombinierte Färbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), Rhodaminylphalloidin (RPh) und indirekte Immunfluoreszenz wurden die DNA sowie Bestandteile des Cytoskeletts (F-Actin und β-Tubulin) sichtbar gemacht. So sollte eine räumliche Analyse des Furchungsmodus bzw. der Blastomerenanordnung ermöglicht werden; weiterhin sollten indirekte Rückschlüsse zur kausalen Beteiligung des Cytoskeletts an der oben beschriebenen Drehung, an Formveränderungen und an der Cytokinese gezogen werden. Es bestand die Hoffnung, den durch elektronenmikroskopische Untersuchungen postulierten kontraktilen Bogen (Abb. 1) (Schroeder 1968; Szollosi 1970) erstmals bei Coelenteraten auch fluoreszenzmikroskopisch sichtbar zu machen.

      Die Hemmstoffe des Cytoskeletts Cytochalasin B und Nocodazol wurden eingesetzt, um direkte Rückschlüsse auf die eben beschriebenen Aspekte Drehung, Formveränderung, Cytokinese und Zusammenwirken der Cytoskelettelemente ziehen zu können.

       Abb. 1

      Schematische Darstellung der Anordnung der Filamente des kontraktilen Bogens bei der ersten Furchung des Eies von Stomatoca atra. Aus Schroeder (1968).

      Oben: Räumliche Darstellung des Eies (links) und Schroeders Interpretation seiner elektronenmikrospkopischen Daten in bezug auf die Anordnung der Filamente im Ei (rechts).

      Mitte und unten: Darstellung der Schnittebenen (links) und der jeweils am elektronenmikroskopischen Schnitt gefundenen Anordnung der Filamente.

      

2 Material und Methoden

      2.1 Hälterung der Versuchstiere

      Die verwendeten Versuchstiere wurden an der Biologischen Anstalt Helgoland (BAH) aus der Nordsee gedredged oder getaucht. Die Polypenkolonien von Hydractinia echinata wachsen auf von Einsiedlerkrebsen (Pagurus bernhardus) bewohnten Schneckenschalen (meist von Buccinum oder Littorina). Meist ist jede Schale zusätzlich von dem Polychaeten Nereis fucata bewohnt. Die meisten Einsiedlerkrebse und Nereiden wurden aus den Schneckenschalen entfernt, um die Handhabung