HPLC optimal einsetzen. Группа авторов

diversen Umlenkeinrichtungen (z. B. gekrümmte Multipole) und Beschleunigungselektroden in der Form von Prallplatten mit schmaler mittiger Durchlassöffnung (Skimmer). Angesichts der Vielfalt von Bautypen ist es nicht sinnvoll, hier eine allgemeine Optimierungsreihenfolge zu beschreiben, zumal die Optimierungen von der Art des Bauteils und seiner Position entlang der Ionenflugstrecke abhängen. Gleiches gilt für den Massenanalysator selbst; gestaffelte Quadrupole erfordern nachvollziehbarerweise andere Einstellungen als Ionenfallen, Orbitraps oder Flugrohre. Änderungen an den Parametern des Massenanalysators und des dahinter befindlichen Ionendetektors (sofern vorhanden) bestimmen die Massengenauigkeit (sie wird im Rahmen der Kalibrierung optimiert) mehr als die Empfindlichkeit. Daher werden diese Einstellungen meist universell für einen bestimmten Massenbereich optimiert, nicht aber für jedes individuelle LC-MS-Analysenproblem. Zur bestmöglichen Ionenfokussierung und für einen maximalen, selektiven Ionentransfer in den Massenanalysator geben die Herstellerhandbücher in der Regel ausführlich Auskunft und geeignete Hilfestellung. In der Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass es sich nur in wenigen Fällen diese MS-intrinsischen Parameter zu optimieren lohnt, z. B. wenn im Forschungsumfeld die Nachweisgrenze eines Expertensystems auf das Letzte ausgereizt werden muss. Im industriellen Routineeinsatz lohnt der Zeitaufwand der Optimierung oft den Gewinn an Empfindlichkeit nicht.

      Zum Abschluss der MS-Optimierung empfiehlt es sich, die Infusion der Tuninglösung mit den optimierten Einstellungen für 1–5 min kontinuierlich als einen Referenzdatensatz aufzuzeichnen. Diesen begutachtet man anschließend bezüglich der Spray- bzw. Signalstabilität und ermittelt sowohl aus der LC-MS-Datenspur das Basislinienrauschen als auch aus einem repräsentativ gemittelten Satz an MS-Spektren die Qualität des Spektrums hinsichtlich Verunreinigungen und Form der Massensignale, das Signal-zu-Rauschen für die charakteristischen Isotopensignale, die Verteilung der Isotopenintensitäten sowie die erzielte Massenauflösung. Bei HR/AM- Messungen sollte zudem die Massengenauigkeit als Maß der Abweichung zwischen theoretischer und experimentell gemessener Masse in ppm bestimmt werden.

      Empfehlungen

       • Durch sequenzielle Optimierung der lonenoptikeinstellungen innerhalb des Mittel- und Hochvakuumbereichs des Massenspektrometers kann die Empfindlichkeit weiter gesteigert werden.

       • Herstellerangaben helfen bei der Identifikation der wirkmächtigsten Einstellungen.

       • Eine Optimierung des Massenanalysators (Kalibrierung) ist nur für bestimmte Massenbereiche sinnvoll, nicht aber für jede individuelle Probenart.

       • Aufnahme eines Referenzdatensatzes für 1–5 min

       • Auswertung von Signalstabilität, Qualität des Massenspektrums, Signal-zu-Rauschen und Massenauflösung

      3.2.4 Überprüfung der Komplettmethode

Im abschließenden Schritt werden nun LC-Trennung und MS-Detektion methodenseitig zusammengeführt. Wer es eilig hat, installiert einfach die benötigte Trennsäule, koppelt die UHPLC-Anlage fluidisch mit dem MS-Ionenquelleneinlass und startet eine Trennung einer (matrixfreien) Standardlösung mit den separat optimierten Bedingungen für UHPLC und MS. Die Chance, dass dies auf Anhieb funktioniert, ist recht hoch. Oft muss man jedoch MS-Quellenparameter nachkorrigieren, weil sich in der Gradientelution die tatsächliche Elutionsmittelzusammensetzung für einen Analyten deutlich von der Zusammensetzung des Tuningexperimentes unterscheidet. Die auf eine isokratische Eluentenzusammensetzung hin optimierten Quellenparameter sind nicht optimal geeignet für deutlich abweichende Mischungsanteile an Wasser und Organik. Bevorzugt beobachtet man dies im wasserreichen, „nassen“ Bereich des Elutionsprogramms, wo es häufiger zu Tröpfchenbildung, erkennbar an Spikes in der Signalbasislinie, kommt. In Extremfällen muss man zu unterschiedlichen Zeiten des Chromatogramms mit individuell auf dieses Zeitsegment angepassten Quelleneinstellungen arbeiten. Die marktüblichen MS-Kontrollprogramme erlauben zwar keine kontinuierliche Änderung von Quellenparametern, wie z. B. einen Druckgradienten über die Zeit für das Vernebelungsgas. Zumindest aber ist die Unterteilung des Trennzeitfensters in unterschiedliche MS-Detektionssegmente möglich, für die unabhängige Einstellungen definiert werden können. Die Erfahrung zeigt aber, dass dies in vielen Fällen nicht nötig ist und man mit ein wenig Geschick rasch zu einem globalen Satz an MS-Einstellungen gelangt, mit dem über das komplette Elutionsfenster hinweg zuverlässig gearbeitet werden kann.

      Wer lieber methodisch ausführlicher vorgeht, legt vor der ersten LC-MS-Trennung noch einen Zwischenschritt ein, in dem die UHPLC-MS-Kopplung einschließlich eingebauter Trennsäule apparativ lauffertig aufgesetzt, allerdings zwischen Säule und Massenspektrometer wieder wie beim MS-Tuning über ein T-Stück eine Spritzenpumpe angeschlossen wird. Man lässt dann die UHPLC-Anlage Blindgradienten ohne Probeninjektion durch den Probengeber fahren und speist wiederum eine Analytlösung hinter der Säule über das T-Stück kontinuierlich zu. Mit diesem Aufbau lässt sich rasch ermitteln, ob die beim MS-Tuning ermittelten MS-Detektionsparameter über den gesamten Gradientelutionsbereich hinweg ausreichend gute Resultate erlauben und wie sich das Analytsignal im Massenspektrometer in Abhängigkeit der Laufmittelzusammensetzung ändert. Gleichermaßen kann man anhand der Blindgradienten ohne Nachsäuleninfusion bestimmen, inwieweit sich das Basislinienrauschen über den Gradienten hinweg ändert, z. B. durch unsaubere Lösemittel, vermehrtes Säulenbluten oder Verunreinigungen aus der Apparatur. Für Realproben von hoher Bedeutung ist zudem die Bestimmung von Matrixeinflüssen (Ionensuppression), die auf ähnliche Weise mit einer Matrixlösung bestimmt werden kann [1]. Nach einer solchen Überprüfung der LC-MS-Methode auf ihre Tauglichkeit hin kann mit den üblichen Verfahrensschritten einer Methodenvalidierung fortgefahren werden.

      Empfehlungen

       • Die Basislinienstabilität kann mit den im MS-Tuning optimierten Einstellungen unter der sich ändernden Lösemittelzusammensetzung der Gradientelution in manchen Gradientenabschnitten leiden.

       • Zeitsparender Ansatz zur Kopplung: Aufsetzen der gekoppelten Methode und Testinjektion mit gegebenenfalls erforderlicher Modifikation der Quelleneinstellungen

       • Ausführlicherer Ansatz: Blindgradienten über die Trennsäule werden durch Nachsäuleninfusion einer Analytlösung im Massenspektrometer aufgezeichnet, bevor die Probe endgültig in der LC-MS-Trennung untersucht wird.

       • Bestimmung von Matrixeinflüssen durch Nachsäuleninfusion

3.2.5 Unterstützung bei der Methodenentwicklung durch softwaregestützte Parametervariation

      Wie die vorigen Abschnitte zeigten, bedeutet die Entwicklung und Optimierung einer LC-MS-Methode viele einzelne Schritte, die zu automatisieren einen deutliche Zeitersparnis bedeutet und durch eine umfassendere Untersuchung des Parameterraums auch zu robusteren Methoden führen kann. Der Markt bietet eine Vielzahl von Softwarepaketen, die sich mit der Simulation von Flüssigchromatogrammen, statistischer Versuchsplanung, Quality-by-Design-Konzepten und automatisierter Methodenentwicklung beschäftigen (s. Kap. 10, 11, 20). Es muss jedoch nicht immer gleich ein zusätzliches Expertenprogramm sein. Auch gängige Chromatographiedatensysteme (CDS) bieten mitunter bereits mit Bordmitteln intelligente Möglichkeiten, Maschinen automatisiert den Weg zu bestmöglichen Trenn- und Detektionsbedingungen suchen zu lassen. Ein Beispiel sei hier kurz beschrieben. Manche Chromatographiedatensysteme wie Thermo Scientific™ Chromeleon™ bieten die Möglichkeit, für Instrumentenmethodendateien eigene Variablen zu deklarieren (sog. Custom Variables) und diese beim Aufruf durch die Software mit Werten aus einer Sequenztabelle zu füllen (Abb. 3.2). Damit spart man sich den Aufwand, für jede geänderte Detektionseinstellung (oder auch LC-Trennbedingung) eine eigene Methodendatei anzulegen. Dies bietet eine elegante und zügige Möglichkeit, nicht nur LC-Trennungen automatisiert zu optimieren, sondern auch die MS-Detektionsbedingungen. Anwender:innen deklarieren die Parameter der unterstützten Ionenquellen als